Wrights fläckfundament, material, teknik och användningsområden



den Wrigths fläck är en färgteknik skapad av den amerikanska patologen James Homer Wright 1902, från Romanowskys fläck. Eftersom Romanowskys fläck var instabilt infördes Wrigth metanol som lösningsmedel och fixativ.

Denna färg är polykromatisk, vilket innebär att det genererar flera färger beroende på strukturen som färgämnet absorberar. Denna färgningsteknik har i stor utsträckning använts för differential vita blodkroppar och studera morfologi röda blodkroppar, trombocyter och leukocyter i perifert blod och benmärg.

Dess tillämpning är mycket viktigt eftersom abnormiteter kan ses i blodets olika cellinjer, vilket underlättar diagnosen av sjukdomar som leukemi eller bakteriella eller parasitära infektioner.

Kanske är dessa de vanligaste tillämpningarna där denna teknik används, men de är inte de enda. Det är också användbart i andra prov än blod och benmärg, såsom prov av nasal urladdning, fekal slem, sputum, hud, bland andra..

index

  • 1 Foundation of Wrights fläck
  • 2 material
    • 2.1 Framställning
    • 2,2 buffertbuffertlösning
    • 2.3 Ytterligare material som behövs för att utföra färgningen
  • 3 delar av Wrights fläck
    • 3,1 metanol
    • 3.2 Stötdämparen
    • 3.3 Eosin (Y)
    • 3,4 metylenblå
  • 4 Teknik
  • 5 Utility
    • 5,1 hematologi
    • 5.2 Nasal Sekretion
    • 5.3 Parasitologi
    • 5.4 Respiratoriska infektioner
    • 5.5 Bakteriologi
    • 5,6 Mykologi
  • 6 Hur observeras strukturerna i blodprovet med Wrights fläck??
  • 7 rekommendationer för bra färgning
  • 8 Vanliga misstag vid Wrigth-färgning
    • 8.1 Mycket blek färgning
    • 8.2 Nedfall av färgämnet
    • 8.3 Smörj med extremt rödaktig eller blå färg
  • 9 Lagringsläge
  • 10 referenser

Wrights fläckfundament

Wright stain född Romanowsky-färgning, som består av en lösning av metylalkohol ett surt färgämne (Eosin Y) och en basisk (metylenblått) och deras oxidationsprodukter.

Färgblandningen som används i Wright stain har effekten kallas Romanowsky, dvs ger en vacker lila färgning mot kärnorna hos leukocyter och neutrofila granuler, medan röda blodkroppar är färgade rosa.

Komponenterna som är ansvariga för att ge den typiska utbud av färger Wright stain är blå B och eosin Y. Effekten observeras beror på bindningen av färgämnen till de kemiska strukturerna och interaktioner av blått B och Eosin Y.

Sura strukturer som nukleinsyror, kärnproteiner och reaktiv omogen cytoplasma av vissa celltyper, fixa blå B (basfärg).

Medan de grundläggande strukturerna, såsom hemoglobin, fixerar granulerna i segmenterade eosinofiler, bland andra cellulära strukturer, eosinet Y (surt färgämne).

Resultatet av färgning kan påverkas av olika faktorer, såsom pH för Wright-färgämnet, bufferten och tvättlösningen; såväl som färgning och fixeringstid.

Därför är varje steg i beredningen av reagensen avgörande och måste ske med att ta hand om varje detalj.

material

Wright färgläggning. För 100 ml krävs det:

Väg 0,3 g av Wright-färgämne, mäta 97 ml metanol och 3 ml glycerol.

beredning

Placera den stora mängden Wrights färgämne i en murbruk och tillsätt långsamt glycerol tills pulvret är helt upplöst..

Sedan tillsättes metanolen, blandas och hälles i en gult flaska.

Före användning ska lösningen skakas med försiktiga rörelser och filter.

Buffertbuffert

I en liter destillerat vatten tillsattes 3,76 g dinatriumhydrofosfat (Na2HPO4   2H20) plus 2,1 g kaliumdihydrogenfosfat (KH)2PO4).

Blanda mycket bra tills alla inkorporerade reagens är upplösta. Justera pH till 7.2. Häll i en glasburk och håll vid rumstemperatur.

Ytterligare material som behövs för att utföra färgningen

ark nosstycke eller coverglass, bro färgämnen pisetas med vatten eller buffert för tvättning, en timer för att utföra färgningstider och ett torkmedelsmaterial: dessutom andra material för att utföra färgningsteknik, dessa krävs (absorberande papper, gasbind eller bomull).

Wright-fläckkomponenter

metanol

Alkohol (metanol) tjänar som fixativ av blodsprutet till glidbanan.

I grund och botten är det ett reducerande reagens, dehydrator och koaguleringsfixativ. Därför är dess funktion att koagulera proteinerna och göra dem olösliga, utan att deatureras dem.

Metanol är det mest använda reagenset för att fixera smuts i alla laboratorier, eftersom det ger bättre resultat än de som erhållits med etanol. Den ideala koncentrationen är 99%.

Stötdämparen

Bufferten (buffrad lösning) har funktionen att justera eller bibehålla pH hos färgämnet, eftersom ett pH justerat till 7,2 är väsentligt för cellstrukturer för att absorbera färgämnen korrekt.

Å andra sidan dehydrerar passage av metanolfixering cellerna och bufferten hjälper till att rehydrera dem.

Eosin (Y)

Eosin har en affinitet för basiska komponenter eftersom det är ett surt färgämne. Två typer av eosin är väldigt lika varandra, så var och en av de två kan användas, vilket ger samma resultat.

Den ena kallas eosin Y, eosin gul eller tetrabrom och andra eosin B, erytrosin B eller dibromodinitrofluoresceína blå. Eosin Y är emellertid den vanligaste.

Den viktigaste egenskapen hos denna färgämne är dess negativa polaritet, vilket gör att den attraheras av cellulära strukturer med positiv laddning.

Methylenblå

Det är den grundläggande färgen. Dess huvudsakliga egendom är metakromasi, det vill säga inte alla strukturer kommer att färgas i samma färg, det beror på den kemiska sammansättningen av de strukturer som den färgar.

Vissa kommer att bli ljusa eller mörkblåa och andra mörka lila eller bleka lila.

teknik

1 - Utför spridningen av provet så att en tunn film kvarstår, antingen på en glid eller täckglas.

2-Låt lufttorka i ca 2 timmar.

3-Placera torrfärgen på färgningsbroen eller färgfacket med provet spridas uppåt.

4-Täcka arket med Wright-färgämnet droppvis tills det täcker hela ytan. Lämna på i 5 - 8 minuter.

5-Färgen bör helt täcka gliden, utan att spillas över kanterna. Om det under färgtiden börjar det att förångas, bör ytterligare droppar placeras.

6 - Lägg sedan till en lika stor mängd av stötdämparen, blåsa lite tills den karakteristiska metalliska glansen visas. Ta 10 till 15 minuter.

7-Tvätta med kranvatten, placera den mjuka strålen tills arket ser rosa ut.

8 - Med en gasbindning impregnerad med alkohol avlägsnar färgämnet på baksidan av bilden.

9 -Låt smetret torka mycket bra innan du placerar nedsänkningsoljan för att visualisera det i mikroskopet.

användbarhet

hematologi

Den är idealisk för utsmyckning av perifera blodutslag, för att undersöka tjocka blodutslag och för att studera celler från benmärgsprover.

På grund av de kemiska egenskaperna hos denna kombination av färgämnen kan de cellulära strukturerna lätt identifieras, kunna särskilja de olika typerna av celler närvarande.

Nasal sekretion

Denna teknik är mycket användbar för att identifiera cellerna i nasal sekretionen (epitelceller, segmenterade eosinofiler, polymorfonukleära) vid diagnosen allergisk rinit.

parasitologi

I den meningen har det varit användbart för studier av Leishmania sp inom histiocyterna av den subkutana cellulära vävnaden i hudår. På samma sätt används det för att identifiera leukocyter i pallprover (fekal leucogram).

I detta fall är det av intresse för läkaren att veta om leukocytosen som finns i avföringen är av polymorfonukleär eller mononukleär. Detta resultat i fekalleukogrammet kommer att styra om det är en bakteriell eller viral infektion respektive.

Å andra sidan kan parasiterna som cirkulerar i blodet hittas inuti erytrocyten eller fritt i plasman. De önskade parasiterna är Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii och filarias, och i veterinärmedicinen är det användbart i sökandet efter Theileria equi och Babesia caballi, orsakssamband till barn, särskilt hos hästar.

Wright och Giemsa fläckar kan skilja hemoparasiter från normala cellulära komponenter. För detta kan du använda två typer av spreads:

Fina sträckor

Blodet sprids ut som en tunn film på en bild. Färgad med Wrights fläck, vilket avslöjar kärnans egenskaper och cytoplasma.

Tjock droppe

Denna metod används för att undersöka närvaron av parasiter i en större mängd blod.

För detta placeras en stor droppe blod på en bild. En gång där borde du defibrinera, vilket gör större och större cirklar från mitten utåt, med kanten på en annan bild.

Slutligen, för att observera parasiterna i det tjocka utrymmet, måste erytrocyterna lyseras med vatten.

Andningsinfektioner

På andningsnivån är denna teknik också användbar, eftersom cellerna närvarande i sputumprover, bronkial eller bronchoalveolär sköljning är viktiga för att fastställa diagnosen.

På samma sätt kan polymorfonukleära celler och mononukleära celler särskiljas här.

bakteriologi

Användningen av denna teknik i bakteriologi är begränsad, eftersom det inte är bra för färgning av bakterierna, det är därför som för färgning av dem används andra specialiserade färgtekniker.

Det har dock använts för att leta efter epitelceller med inklusionskroppar av Chlamydia trachomatis i utstryk av urinrör eller endocervikal slemhinna, även om det måste erkännas att det inte är den bästa metoden för detta.

Det är också möjligt att observera bakterier av spiraltyp bland de röda blodkropparna som Borrelia burgdorferi hos infekterade patienter, liksom morulae eller inklusionskroppar av Ehrlichia sp i cytoplasma av lymfocyter, monocyter eller neutrofiler i ett blodsprut.

mykologi

den Histoplasmakapselatum är en patogen svamp diagnostiserad ofta genom mikroskopisk observation av olika vävnadsprover, färgade med Wrights fläck.

Hur observeras strukturerna i blodprovet med Wrights fläck?

Rekommendationer för bra färgning

Förlängningar av blodprover bör lufttorkas spontant. Utspädningarna ska vara så tunna som möjligt för att få en bättre fixering av färgämnet och undvika överkoloreringar.

För färgning av hög kvalitet är det lämpligt att utföra färgningen under de två timmar som följer efter smörjframställningen. Å andra sidan är det perfekta provet kapillärblod utan antikoagulant.

Om venös blod används, ska det emellertid användas som EDTA-antikoagulant och inte heparin, eftersom det senare kan deformera cellstrukturer.

För att förhindra försämring av beredda färgämnen bör förvaras på torra platser.

Under tvättprocessen rekommenderas användning av vatten justerat till neutralt pH.

Slutligen är det lämpligt att testa de färgningsmetoder som används i laboratoriet så ofta.

Detta görs genom färgning av prov eller förlängda mönster, som en kvalitetskontroll. Detta steg är viktigt, eftersom detta säkerställer att färgningen är ordentligt förberedd och färgtiderna är väl standardiserade.

Om mönsterskivan är dåligt färgad, finns det problem som måste lösas.

Vanliga misstag vid Wrigth-färgning

Mycket blek färgning

Mycket bleka smuts, vanligen på grund av mycket kort tid för färgning eller en mycket överdriven tvätt. Det korrigeras genom att förlänga kontakttiden med färgämnet eller genom att minska tvätttiden.

Färg utfälls

Utfällningen färgämnes smear kan ha flera orsaker, men de vanligaste orsakerna är: användning av färgämne ofiltrerad färgämne på broar färgning ojämn, med användning av smutsiga blad med damm eller fett, gör en bra tvätt den Avsluta färgningen.

Smörj med extremt rödaktig eller blå färg

Bufferten är ansvarig för pH hos färgämnet. Färger med pH under den angivna (sura) kommer att resultera i mycket röda smuts.

Om färgets pH är över (alkaliskt) kommer en extremt blåaktig smet att erhållas.

Lagringsläge

Reagenset bör förvaras vid rumstemperatur.

referenser

  1. V. Gutierrez jämförande studie mellan Wright färgningsmetoden och Elisa test för diagnos av hund ehrlichiosis i staden San Pedro Sula, Honduras. 2008. Examensarbete för att ansöka om veterinärmedicinska doktorns titel. Universitetet i San Carlos de Guatemala.
  2. Lopez-Jácome L, Hernandez-Durán M, C colin-Castro, Pena-Ortega S, G Cerón-Gonzalez, F. Franco-Cendejas Basiska färgämnen i mikrobiologiskt laboratorium. Forskning om funktionshinder. 2014; 3 (1): 10-18.
  3. "Wrights fläck." Wikipedia, den fria encyklopedin. 18 maj 2018, 12:05 UTC. 8 dec 2018, 20:37
  4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frekvens av Babesia spp. i hästar av montería, Córdoba (Colombia). Rev. utcaactual divulg cient.  2013; 16 (2): 451-458.
  5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Mikrobiologisk diagnos av Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Panamericana S.A Redaktionell.
  6. Retamales E, Mazo V. Folkhälsoinstitutet, regeringen i Chile. Rekommendationer för färgning av blodutslag för att läsa blodtalet.