Gram fläck foundation, material, teknik och användningar



den Gram fläck är den enklaste och mest användbara färgtekniken i diagnostisk mikrobiologi. Denna teknik skapades av den danska läkaren Hans Christian Gram 1884, som lyckades klassificera bakterierna i Gram-positiv och Gram-negativ, enligt cellväggens sammansättning.

Tekniken lidit modifieringar av Hucker i 1921 för att stabilisera reagenserna och förbättra kvaliteten på färgning, så Gramfärgning är också känd som Gram-Hucker.

Med denna teknik är det möjligt att observera form av mikroorganismer, det vill säga om kocker, baciller, coccobacilli, pleomorfa, fintrådiga, bland annat. Förutom dess fördelning i rymden: i kluster, i kedja, isolerade, parvis, i tetrader etc..

När en bakteriell infektion misstänks, ska de flesta av de mottagna proven sprida sig på en glid och färgas med gram för undersökning under mikroskopet..

Grams rapport kommer att vägleda läkaren om vilken typ av mikroorganism som kan orsaka infektionen innan man får det slutliga resultatet av grödan.

I vissa fall är mycket engagerad patientens liv, så läkarna måste snarast placera Gram rapport empirisk behandling i väntan på identifiering av organismen.

Till exempel om den Gram avslöjar det grampositiva kocker i CSF, läkaren styra initial antibiotikabehandling för att eliminera dessa typer av bakterier, enligt protokoll som fastställts för detta.

När det slutliga resultatet anländer med namnet på den isolerade mikroorganismen och dess respektive antibiogram, kommer läkaren att utvärdera huruvida behandlingen ska ändras eller ej. Detta beslut kommer att fattas enligt studien av mikroorganismernas mottaglighet mot antibiotika som den mottar och patientens utveckling.

index

  • 1 Stiftelsen
  • 2 material
  • 3 Framställning av färgämnen och reagenser
    • 3.1 Crystal violett lösning
    • 3.2 Iodo-Lugol
    • 3.3 Blekning
    • 3.4 Kontrast
  • 4 Förvaring av reagens
  • 5 Förberedelse av spridningen av provet som ska färgas
    • 5,1-gram av direkta prover
    • 5,2-gram avgrödor
  • 6 Teknik
  • 7 Utility
  • 8 Vanliga misstag
  • 9 referenser

foundation

Detta är en teknik som presenterar 4 grundläggande steg: färgning, fixering med mordant, missfärgning och kontratinktion. Därför skiljer sig denna teknik förutom att färga bakterierna också dem.

Kristallviolen är det första färgämnet som används. Den har en affinitet för peptidoglykan och fläck lila alla bakterier sedan Lugols, i egenskap av betningsmedel, som är placerad, kommer att inducera bildningen av olösliga komplex av kristallviolett-jod - ribonuclear proteiner inom cellen.

Gram-positiva bakterier, som har en tjock vägg av peptidoglykan, bildar mer komplex (kristallviolett-jod), därför behåller de färgen.

Det påverkar också att den Gram-positiva bakterieväggen innehåller en större mängd omättade syror, som visar en hög affinitet för oxidationsmedel (Lugol).

Under tiden har gramnegativa bakterier ett tunt lager av peptidoglykan, vilket gör bakterier mindre komplexa än gram-positiva bakterier.

Sedan kommer steg av missfärgning, där Gram-positiva och Gram-negativa bakterier beter sig olika.

Gram-negativa bakterier innehåller ett yttre membran som är rik på lipopolysackarider som är en del av sin cellvägg. Fetter förstörs genom kontakt med alkohol aceton, så det yttre membranet destabiliseras, den violetta kristallen frigörs.

Så är det då kontrasterat med safranin eller basfuchsin och tar färgen röd.

I fallet med grampositiva bakterier, beständiga att avfärgning verkar för att stänga porerna, som förhindrar violett / jodkomplex kristall kan komma undan.

Därför är färgningen med den violetta kristallen stabil, och det finns inget utrymme för safranin eller fuchsin. På grund av detta fläckar dessa bakterier intensivt blått eller lila.

material

Gramfärgningssatsen består av:

  • Violett kristall
  • Lugols
  • Acetonalkohol
  • Safranin eller grundläggande fuchsin

Framställning av färgämnen och reagenser

Crystal violett lösning

Lösning A:

Violett kristall -2 gr

Etylalkohol 95% -20cc

Lösning B:

Ammoniumoxalat -0,8 gr

Destillerat vatten-80 cc

För den slutliga beredningen av kristallviolett lösning måste spädas 1:10 med destillerat vatten och blandades med 4 delar av lösning B. Blandningen lagrade under 24 timmar före användning. Den filtreras i en kolv för gulfärgning med hjälp av ett pappersfilter.

Mängden som kommer att användas dagligen överförs till en gult flaska med droppare.

Jod-Lugols

Väg och mäta den angivna mängden av varje förening, enligt följande:

Iodos kristaller - 1gr

Kaliumjodid - 2gr

Destillerat vatten -300 cc

Kaliumjodiden löses litet efter i vattnet och sedan tillsätts jod. Lösningen är rakad till en gulfärgad flaska.

Mängden som kommer att användas dagligen överförs till en mindre gult flaska med droppare.

blekning

95% etylalkohol -50 ml

Aceton - 50 ml

Den är förberedd i lika delar. Täcka väl, det tenderar att avdunsta.

Placera i en flaska med dropper.

Denna beredning ger en missfärgning i måttlig tid 5-10 sekunder och är den mest rekommenderade.

Nybörjare föredrar att använda endast 95% etylalkohol, där missfärgning är långsammare från 10 till 30 sekunder.

Medan den mest erfarna kan använda ren aceton, där missfärgning sker mycket snabbt från 1 till 5 sek.

kontrast

Safranin stamlösning

Safranina -2,5 gr

Etylalkohol 95% -100 cc

Efter vägning upplöses den angivna mängden safranin i 100 ml etylalkohol till 95%.

Arbetslösningen av safranin framställs från stamlösningen.

För att göra detta mäter 10 cc av stamlösningen, tillsätt 90 cc destillerat vatten för att slutföra 100 ml.

Det rekommenderas att överföra mängden som kommer att användas dagligen till en gult flaska med en droppare.

Mikroorganismer som fläckar svagt gramnegativa med Gram-Hucker-fläck, såsom vissa anaerober, Legionella sp, Campylobacter sp och Brucella sp, de kan bli mycket bättre färgade om modifieringen gjord av Kopeloff till Gram-Hucker-färgning, kallad Gram-Kopeloff-fläck, används.

Denna teknik förändrar safraninfärgen med grundläggande fuchsin. Med denna modifiering är det möjligt att effektivt färga de tidigare nämnda mikroorganismerna.

Förvaring av reagens

Beredda färgämnen bör förvaras vid rumstemperatur.

Beredning av prov spridd till färg

Ett prov måste innehålla minst 105 mikroorganismer före observation av mikroorganismen i ett smet är sannolikt. Spridningar kan göras från direktprovet eller kulturer i fast eller flytande media.

Spridningar ska vara likformiga, välfördelade och inte för tjocka, för en bättre visualisering av de närvarande strukturerna.

-Gram av direkta prover

Urin gram utan centrifug

Urin blandas och 10 μl placeras på en bild. Observationen av minst ett bakterie / immersionsfält indikerar att det finns en infektion.

Detta innebär att kulturen kommer att ha ungefär mer än 100 000 CFU / ml (105 CFU / ml) urin i 85% av fallen.

Denna metod är inte användbar för kolonnantal under 100 000 CFU.

LCR Gram

CSF bör centrifugeras, supernatanten avlägsnas och pelleten sprids på en bild. Denna vätska är steril under normala förhållanden; observation av bakterier indikerar infektion.

Gram respiratoriska prover

Gram sputum, bronkial eller bronkoalveolär lavage, medan det kan finnas olika mikroorganismer, alltid orientera vid diagnos samt vara användbar typ celler som observerats.

I fallet med sputum bör smeten framställas med de mest purulenta delarna av provet.

Pall pall

Det rekommenderas inte att utföra Gram till denna typ av prover, eftersom det inte har något diagnostiskt värde.

-Gramgrödor

De kan göras på två sätt, en från flytande grödor och en annan från fasta grödor.

Flytande grödor

Från flytande kulturer är det extremt enkelt; under tända flera Rostad smutsiga buljong de tas och placeras på en ren torr diabilder, vilket ger en cirkulär rörelse från centrum mot periferin, för att fördela materialet jämnt.

Det får torka spontant i luften. När det är torrt fixeras materialet på arket med värme. För detta med hjälp av en klämma passeras arket 3 4 gånger genom Bunsen-brännarens flamma, var försiktig så att det inte brinner materialet.

Laken får svalna och placeras på färgbroen.

Fasta grödor

För att utföra en förlängning för Gram-fläck från en fast kultur, fortsätt enligt följande:

Innan du väljer kolonierna som ska tas, ska bilden utföras och placera två droppar ungefär av steril fysiologisk saltlösning.

Om den ursprungliga odlingsplattan innehåller flera olika typer av kolonier, kommer en isolerad koloni av vardera att väljas för att utföra Gram. Varje koloni kommer att tas med platina slingan för att lösa upp den i saltlösningen som tidigare placerats på bilden.

Cirkulära rörelser ges från mitten till periferin för att fördela kolonin homogent på bilden..

Det får torka spontant i luften. När du har torkat, är arket fixerat med värme, enligt vad som förklarats ovan (flammar gliden med tändaren), var försiktig så att du inte bränner materialet.

Denna procedur måste utföras med varje annan typ av koloni. På en bit papper bör observerad ordning noteras, till exempel:

Koloni 1: Gul beta-hemolytisk koloni: Grampositiva kocker observerades i kluster

Koloni 2: Krämkoloni, utan hemolys: Gram-negativa cokobaciller observerades.

Varje ark måste märkas för att veta vad vi observerar.

teknik

Gramfärgningsteknik är extremt enkel att utföra och relativt billigt och kan inte missas i ett mikrobiologilaboratorium.

Detsamma görs enligt följande:

  1. Fixa smeten med värme och placera på den färgade bron.
  2. Skivan är helt täckt med violett glas i 1 minut.
  3. Tvätta med vatten. Torka inte
  4. Täck plattan med Lugol-lösningen, lämna i 1 minut. Tvätta med vatten. Torka inte.
  5. Blanda i 5-10 sekunder med försiktig agitation i acetonalkohol. Eller placera arket i ett upprätt läge och släpp droppar av avfärgningsmedlet på ytan tills det återstående violetta glaset släpas bort. Överstiga inte.
  6. Tvätta med vatten. Torka inte.
  7. Byt arket på den färgade broen och täck om i 30 sekunder med safranin (Gram-Hucker) eller 1 min med basfuchsin (Gram-Kopeloff).
  8. Tvätta med vatten
  9. Låt torka spontant i vertikal luft.

När du har torkat, sätt 1 droppe nedsänkt olja för att observera det under målet om 100X i det optiska mikroskopet.

användbarhet

Denna teknik medger att man skiljer de morphotypentiala skillnaderna i de flesta bakterier.

Yeasts särskiljas också av denna färg. De tar kristallviolen, det vill säga de fläckar Gram-positiva.

Å andra sidan kan Gram-positiva sporbildande baciller särskiljas, där ett tydligt utrymme observeras inuti bacillusen, där endosporan bildades, även om sporerna inte fläckar väl. För att använda sporer används andra tekniker som Shaeffer-Fulton.

Det bör noteras att denna fläck inte tjänar till att färga alla typer av bakterier, det vill säga det finns fall där färgningen inte fungerar.

I detta fall kan bakterier som saknar en cellvägg nämnas. Till exempel: släktet Mycoplasma, sfäroplaster, Ureaplasma, L-former och protoplaster.

Det fläckar också dåligt bakterier med väggar rik på mykolsyra, som Mycobacteria och intracellulära bakterier som Chlamydias och Rickettsias.

Det är också ineffektivt att fläcka de flesta spirochetalbakterier.

Det finns bakterier av samma släkt som kan observeras i samma prov som Gram-positiva och som Gram-negativa. När detta händer kallas det variabel gramfärg, vilket kan bero på förändringar i näringsämnen, temperatur, pH eller koncentration av elektrolyter..

Vanliga misstag

Blek för mycket

Överdrivning i missfärgningssteget kan leda till observation av falska gramnegativa mikroorganismer.

Vänta inte på tillräckligt med torktid för att tillsätta nedsänkningsoljan:

Detta fel orsakar bildandet av feta miceller som gör det svårt att observera de närvarande strukturerna. Detta händer när oljan sammanfogar de vattenmolekyler som finns i smeten.

Omvänd ordningen för reagenserna:

Ett fel som detta kommer att få Gram-negativa bakterier att visa lila, det vill säga falskt Gram-positivt.

Använd gamla grödor (fast eller flytande):

Det kan orsaka Gram-positiva bakterier att fläcka gramnegativa (falskt gramnegativt). Detta händer eftersom det i de gamla kulturerna är sannolikt att det finns döda eller försämrade bakterier och under dessa förhållanden behåller bakterierna inte den violetta kristallen.

Använd mycket gammal Lugol lösning:

Med tiden förlorar lugol dess egenskaper och färgen tappar. Om det redan degenererade reagenset används, kommer det inte att fixera kristallviolen väl, därför finns möjligheten att få en visualisering av mikroorganismer som är falskt Gram-negativ.

Bluish bakgrund

En korrekt missfärgad bakgrund blir röd. En blå bakgrund indikerar att missfärgningen var otillräcklig.

referenser

  1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. mikrobiologi Medical, 6: e upplagan McGraw-Hill, New York, USA
  2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnos. (5: e upplagan). Argentina, Editorial Panamericana S.A..
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiologisk diagnos av Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Panamericana S.A Redaktionell
  4. Casas-Rincón G. 1994. Allmän Mykologi. 2: a utgåva Universidad Central de Venezuela, Bibliotek utgåvor. Venezuela, Caracas.
  5. "Gram stain" Wikipedia, den fria encyklopedin. 4 okt 2018, 23:40 UTC. 9 dec 2018, 17:11. Hämtad från es.wikipedia.org.
  6. González M, González N. 2011. Handbok för medicinsk mikrobiologi. 2: a upplagan, Venezuela: Direktoratet för media och publikationer vid University of Carabobo.
  7. Lopez-Jácome L, Hernandez-Durán M, C colin-Castro, Pena-Ortega S, G Cerón-Gonzalez, F. Franco-Cendejas Basiska färgämnen i mikrobiologiskt laboratorium. Forskning om funktionshinder. 2014; 3 (1): 10-18.