Sporefärgningsstiftelse, tekniker och användningsområden

den sporefärgning är metoden som används för att färga resistansstrukturerna som bildar någon bakteriell genera när de är i ogynnsamma förhållanden; Dessa strukturer motsvarar ett sätt att överleva.

Det finns många släktingar som bildar sporer; De viktigaste är emellertid Bacillus och Clostridium. Dessa släktingar anses vara mer relevanta eftersom de har patogena arter för människor.

Varje bacillus kan ge upphov till en spore. Vid tidpunkten för färgning av preparatet kan sporen hittas inuti bacillus (endospor) eller utanför den (exospore). Med konventionella färgningstekniker för bakterier - som Gram stain - är sporerna färglösa.

För närvarande finns det flera färgmetoder som kan passera spårets tjocka struktur för att färga den. Dessa metoder är mycket varierade; bland dessa kan vi nämna Dorner-tekniken, Möeller-fläcken och Shaeffer-Fulton-metoden, även känd som Wirtz-Conklin..

Av alla nämnda tekniker är Shaeffer-Fulton-metoden den mest använda i rutinlaboratorier. Den är skyldig till två mikrobiologer som skapade färgningen 1930: Alicia Shaeffer och MacDonald Fulton. Men ibland kallas tekniken Wirtz-Conklin till ära för två bakteriologer från 1900-talet.

index

• 1 Stiftelsen
• 2 Sporfärgningstekniker
  • 2.1 Dorners teknik
  • 2.2 Modifierad Dorner teknik
  • 2.3 Teknik av Shaeffer-Fulton eller Wirtz-Conklin
  • 2.4 Möellerteknik
  • 2,5 Modifierad Möeller-teknik utan värme
• 3 användningsområden
  • 3.1 Exempel
• 4 referenser

foundation

Sporerna fläckar inte med konventionella färgämnen eftersom de har en mycket tjock vägg. Sporernas komplexa sammansättning förhindrar införandet av de flesta färgämnena.

Om spor utanför i studera följande skikt observeras: först är den exosporium, vilket är det tunna yttre skiktet bildas av glykoproteiner.

Sedan kommer kutiklet, vilket ger resistens mot höga temperaturer, följt av cortex sammansatt av peptidoglykan. Sedan finns det väggen på basen som skyddar protoplasten.

Sporan är en dehydrerad struktur som innehåller 15% kalcium och dipikolinsyra. Därför är de flesta sporefärgningsteknikerna baserade på applicering av värme så att färgämnet kan tränga igenom den tjocka strukturen.

När sporet är färgat, kan det inte eliminera färgen. I Shaeffer-Fulton-tekniken tränger malakitgrönt in i vegetativa celler och, vid applicering av värme, tränger igenom endosporan och även exosporerna.

Vid tvättning med vatten avlägsnas färgen från den vegetativa cellen. Detta beror på att den gröna malakitfärgen är lite grundläggande, så den binder svagt till den vegetativa cellen.

Å andra sidan kan det inte komma ur spåret och slutligen är bacillusen med safranin kontrasterad. Denna grund gäller för resten av teknikerna, där något liknande händer.

Spore färgtekniker

För att göra sporerna fläckar måste du ha en ren kultur av den misstänkta stammen som du vill studera.

Odlingen utsätts för extrema temperaturer i 24 timmar för att stimulera mikroorganismen att sporulera. För detta kan kulturen placeras i en ugn vid 44 ° C eller i kylskåp (8 ° C) i 24 eller 48 timmar.

Om för mycket tid lämnas vid de nämnda temperaturerna kommer endast exosporer att observeras, eftersom alla endosporierna kommer att ha lämnat bacillusen.

Vid slutet av tiden bör några droppar steril fysiologisk lösning placeras på en ren glida. Sedan tas en liten del av grödan och en fin spridning görs. 

Efteråt är det kvar att torka, det är fixerat till värmen och det är färgat med några av de tekniker som förklaras nedan:

Dorners teknik

1- Förbered i ett provrör en koncentrerad suspension av den sporade mikroorganismen i destillerat vatten och tillsätt en lika stor volym filtrerad Kinyoun fenol fuchsin.

2- Placera röret i ett bad med kokande vatten i 5 till 10 minuter.

3- Blanda en droppe av den tidigare suspensionen med en droppe 10% vattenlösning av nigrosin, kokt och filtrerat.

4- Utvidga och torka snabbt med mild värme.

5- Undersök med 100X objektiv (nedsänkning).

Sporerna fläckar röda och bakteriecellerna verkar nästan färglösa mot en mörkgrå bakgrund.

Modifierad Dorner teknik

1- En suspension av den sporulerade mikroorganismen sprids på en glid och fixeras till värmen.

2- Provet är täckt med en remsa av filterpapper till vilket tillsätts feninsyrafuchsin. Färgen upphettas i 5 till 7 minuter med Bunsen-brännarens flamma tills utsläpp av ångor bildas. Då tas papperet bort.

3- Tvätta preparatet med vatten och torka sedan med absorberande papper.

4- Täck smeten med en tunn film av 10% nigrosin, använd en andra glid för att sprida nigrosin eller en nål.

Färgen som tas av sporer och bakterier är densamma som den som beskrivits i känd teknik.

Shaeffer-Fulton eller Wirtz-Conklin teknik

1- Gör en tunn spridning med en suspension av sporulerad mikroorganism på en glid och fixera den för att värma.

2- Skydda bilden med en vattenlösning av 5% malakitgrön (ett filterpapper kan placeras på arket).

3- Värm på Bunsenbrännarens flamma för att få ånga att fly och ta bort flamman. Upprepa operationen i 6 till 10 minuter. Om under malningen fördäms malakitgrön lösning för mycket, kan mer tillsättas.

4- Ta bort filterpapperet (om det placerades) och tvätta med vatten.

5- Skydda bilden med 0,5% vattenhaltigt safranin i 30 sekunder (vissa varianter av tekniken använder 0,1% vattenhaltigt safranin och lämnar det i 3 minuter).

Med denna teknik är sporerna gröna och bacillerna är röda.

Det har nackdelen att endosporer av unga kulturer inte fläckar väl, eftersom de ser extremt tydliga eller färglösa ut. För att undvika detta rekommenderas att man använder kulturer med 48 timmars inkubation.

Möeller teknik

1- Täck smeten med kloroform i 2 minuter.

2- Kassera kloroformen.

3- Omslag med 5% kromsyra i 5 minuter.

4- Tvätta med destillerat vatten

5- Skivan är täckt med fuchsin-fenolisk karp och utsätts för Bunsen-brännarens flamma tills utsläpp av ångor; sedan avlägsnas det från flamman under några ögonblick. Operationen upprepas tills den når 10 minuter.

6- Tvätta med vatten.

7- Använd surgjord etanol (saltsyra) för avfärgning. Den lämnas i 20 eller 30 sekunder.

8- Tvätta med destillerat vatten.

9-motverka täcker arket med metylenblått i 5 minuter.

10- Tvätta med destillerat vatten.

11- Det lämnas att torka och provet tas under ett mikroskop.

Sporer ser röda och blåa baciller. Det är viktigt att inte andas in i ångorna, eftersom de är giftiga och på lång sikt kan de vara cancerframkallande.

Modifierad Möeller teknik utan värme

2007 skapade Hayama och hans medarbetare en modifiering av Möeller-tekniken. De eliminerade steget att värma färgämnet och ersättas genom tillsats av 2 droppar ytaktivt Tergitol 7 per 10 ml lösning karbolfuksin-karbol. Samma resultat erhölls.

tillämpningar

Färgning sporer ger en mycket värdefull och användbar för patogen identifieringsinformation, eftersom förekomsten av densamma, form, plats i bacill och förmågan att deformera den vegetativa cellen eller inte, är data som kan vägleda på arten inblandade inom ett visst kön.

I detta sammanhang är det värt att nämna att sporerna kan vara runda eller ovala, de kan vara placerade i mitten eller också i paracentral, subterminal eller terminalposition.

exempel

- Clostridium difficile bildar en oval spore i terminalposition som deformerar bacillusen.

- Spor av Clostridium tertium Det är ovalt, deformerar inte bacillusen och ligger på terminalnivån.

- Endosporan av Clostridium tetani det är terminal och deformerar bacillus, vilket ger utseendet på en trumma.

- Sporerna av Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. Novy och C. septicum de är runda eller subterminala ovala och deformera bacillusen.

- Endosporan av Clostridium sordelli Den ligger i det centrala läget, med en liten deformation.

referenser

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Förslag av en förenklad teknik för färgning bakteriesporer utan att applicera värme framgångsrik modifiering av Moeller: s metod. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Wikipedia bidragsgivare. Moeller fläck. Wikipedia, den fria encyklopedin. 3 november 2018, 03:28 UTC. Tillgänglig på: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Laboratoriehandbok för mikrobiologiska tekniker. Institutionen för grundvetenskap Akademin för mikrobiologi. National Polytechnic Institute.
4. "Endospores." Wikipedia, den fria encyklopedin. 25 februari 2018, 10:20 UTC. 10 jan 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macias J och medarbetare. (2006). Arbetstagare i den autonoma regionen Extremadura. Särskild dagordning Volym IV. Redaktionell MAD. Sevilla-Spanien, sid 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006). Specialist laboratorie tekniker, av den galiciska hälso-och sjukvården (SERGAS). Ämnesspecifik volym 2. Redaktionell MAD. Sevilla-Spanien, sid 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnos. (5: e upplagan). Argentina, Editorial Panamericana S.A..
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiologisk diagnos av Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Panamericana S.A Redaktionell