Agar Müeller Hinton grund, förberedelse och användning

den Müeller Hinton agar Det är ett fast, icke-selektivt näringsmedium, som består av köttinfusion, kaseinsyrapepton, stärkelse, agar och destillerat vatten. Detta medium möjliggör en utmärkt mikrobiell utveckling av snabbast växande bakterier.

Det var ursprungligen skapat av John Howard Müeller och Jane Hinton för att isolera näringskrävande bakterier, till exempel Neisseria gonorrhoeae och Neisseria meningitidis. På grund av dess egenskaper har det dock visat sig vara idealiskt för studiet av mottagligheten för antibiotika, vilket ger pålitliga och reproducerbara resultat.

Därför är Mueller Hinton-agar odlingsmediet accepteras av Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) och Europeiska kommittén on Antimicrobial Susceptibility Testing för utförandet av antimikrobiell känslighetstestning genom diffusion metod disk Kirby och Bauer.

index

• 1 Stiftelsen
• 2 Framställning
• 3 användningsområden
  • 3.1 Antimikrobiell teknik
  • 3.2 Strategisk placering av skivor på Müeller Hinton agar
• 4 Orsaker till felaktiga resultat
• 5 Begränsning
• 6 Kvalitetskontroll
• 7 referenser

foundation

Eftersom det är ett icke-selektivt näringsmedium, är det utmärkt för tillväxten av de flesta patogena bakterier.

Å andra sidan gör den enkla kompositionen att ämnena lätt diffunderar på den, vilket är en väsentlig egenskap för känslighetstestet genom diskdiffusionsmetoden..

En annan egenskap är att den innehåller en låg mängd hämmare, vilket möjliggör effektiv utvärdering av sulfonamider, trimetoprim och tetracykliner..

Man måste emellertid komma ihåg att mediet måste uppfylla vissa villkor för att säkerställa att den fungerar korrekt, inklusive:

PH-justering, agardjup och tillräcklig koncentration av tymin, tymidin, Ca⁺⁺, mg⁺⁺ och Zn⁺⁺.

Vi måste också veta att metoden är standardiserad och därför måste alla parametrar uppfyllas, såsom:

Inokulum koncentrering, koncentrering och bevarande av antibiotiska skivor, placera lämpligt antal skivor på agar, avståndet mellan en skiva och annan strategisk placering av vissa antibiotika, tid atmosfären, temperaturen och inkubation.

beredning

Väg 37 gr av det dehydratiserade Müeller Hinton-mediet och lös upp i 1 liter destillerat vatten. Värm mediet under omröring för att hjälpa till att lösa upp det. Låt koka i 1 minut.

Ta autoklaven för att sterilisera vid 121 ° C i 15 minuter. Vid avlägsnande från autoklaven bör fiolen placeras i ett vattenbad vid 50 ° C för att kyla. Häll 25 till 30 ml i sterila petriskålar 10 cm i diameter.

Plattorna ska ha en genomsnittlig tjocklek på 4 mm (ideal), med ett intervall på 3-5 mm tillåtet.

Om man önskar framställa blodagarbas användning Mueller Hinton-agar, hälldes 5% steril fårblod och defibrinerat före servering plattor.

Det slutliga pH-värdet i mediet bör vara mellan 7,2 och 7,4.

Investera och lagra i kylskåp tills användning. Låt plattan ta rumstemperatur innan den används.

Färgen på det framställda mediet är lätt beige.

tillämpningar

Det används för att utföra antibiogrammet eller antibiotikaresistensprovet till de flesta icke-snabbt växande patogenerna.

Om agar kompletteras med blod, tjänar det till att utföra antibiogrammet av krävande mikroorganismer såsom: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, bland annat. Det har också använts för att isolera Legionella pneumophila.

Antibiogramteknik

Innan antibiogrammet utförs måste en bakterielösning motsvarande 1,5 x 10 beredas⁸ cell.

Att göra detta, ta tre till fyra kolonier från ren kultur och suspenderas i ett sojabuljong tryptikas eller Mueller Hinton-buljong, inkuberades under 2 till 6 timmar, och koncentrationen justerades med steril saltlösning, jämfört med en standard McFarland av 0,5%.

Om de kräver mikroorganismer kan kolonier avbrytas direkt tills de når koncentrationen av 0,5% av Mac Farland. Därefter sås Müeller Hinton-plattan med en tapppinne impregnerad med den beredda bakteriella lösningen.

För att göra detta, doppa doppen i lösningen och ta sedan bort överskottsvätskan genom att trycka mot rörets väggar. Omedelbart efter att vattnet har passerat över hela ytan, lämnar inga orörda platser, vrid sedan plattan något och återsås. Operationen upprepas ytterligare 2 gånger.

Låt stå i 10 minuter och placera antibiotikumskivorna med en steril pincett, vilket ger ett utrymme på 24 mm mellan dem. Efter att du har placerat varje skiva på agar trycker du lätt på var och en med klämman för att säkerställa att de är väl vidhäftade.

Efter processen är plattan inverterad och inkuberad vid 35-37 ° C i aerobios i 16-18 timmar. Om det är en krävande mikroorganism kan det kräva mikroaerofili och om antibiotikumet innehåller oxacillindiskar ska det läsas 24 timmar.

En linjal används för att mäta diametern för varje halo. Resultaten ska registreras i mm. Därefter korreleras de erhållna värdena med tabellerna av skärpunkter som publiceras av den nuvarande CLSI-handboken.

Rapportera som känslig (S), mellanliggande (I) eller resistent (R), beroende på vad som är fallet.

Antibiotika väljes enligt den isolerade mikroorganismen och typen av infektion som uppträder.

Ibland bör den strategiska placeringen av antibiotika betraktas som fenotypiska resistansmönster.

Strategisk placering av skivor på Müeller Hinton agar

För enterobakterier måste clavulansyraskivan placeras framför 3: e och 4: e generationens cefalosporiner. En äggformad utvidgning indikerar att stammen är en producent av beta-laktamaser med utvidgad spektrum (ESBL). Detta innebär att patienten inte ska behandlas med något cefalosporin.

I Staphylococcus är det viktigt att placera erytromycin eller azitromycinskivan framför clindamycinskivan (D-test).

Resistent erytromycin halo och halo plattning av klindamycin indikerar att stammen har en resistens mot klindamycin inducerbar stam (RIC). Detta innebär att behandling med clindamycin inte kommer att vara effektiv.

Sökning efter AMP C inducerbara stammar i Enterobacteriaceae och vissa icke-fermenterande Gram negativa baciller, skivor ceftazidim, cefoxitin eller piperacillin tazobaktam kontra imipenem skivytan på ett avstånd av 27 mm.

En halo utplattad i en av skivorna mot imipenem indikerar närvaron av inducerbar AMP C.

Söka efter konstitutiv AMP C kloxacillin skiva 500 ug med ceftazidim (30 mg) och cefotaxim (30 mg), på ett avstånd av 25 mm ansikten. En utvidgad halo i en av cefalosporinerna indikerar positivitet.

Cloxacillin skivan kan också ersättas med en 9 mm skiva av Whatman nr 6 filterpapper impregnerat med fenylboronsyra (400 μg) med ett avstånd på 18 mm. Det tolkas som det föregående.

Slutligen, för att undersöka produktionen av metallo-beta-laktamaser, särskilt i Pseudomonas aeruginosa, impregnerad skiva används med 10 ul etylendiamintetraättiksyra (EDTA 750 g) och tioglykolsyra (SMA 300 mg), som är vänd mot imipenem och meropenem skivor, på ett avstånd av 15 mm.

Testet är positivt om det finns en utvidgning av imipenem- eller meropenemhalogen mot EDTA / SMA-skivan. Detta resultat måste bekräftas av det modifierade Hodge-testet.

Denna metod består i att inokulera en stam av Escherichia coli ATCC 25922 på Müeller Hinton-plattan. En imipenem-skiva placeras i mitten av plattan och sedan tillverkas en flöjt från skivan mot periferin med belastningen av P. aeruginosa misstänkta. Du kan testa upp till 4 stammar per platta.

Testet kommer att vara positivt om det finns en distorsionszon av imipenemhalogen runt stria.

Orsaker till felaktiga resultat

-Skivor av dåligt bevarade antibiotika kan ge falska resistanser. Till exempel är oxacillinskivan mycket sårbar för temperaturförändringar.

-Ett pH av mediet under den indikerade (syra) ger mindre glorior i aminoglykosider och makrolider (risk för falsk motstånd), och större ljusgårdar penicillin, tetracyklin och novobiocin (risk för falsk känslighet).

-Om pH-värdet är över det angivna (alkaliska) reverseras de ovan beskrivna effekterna.

-Medier med högt tymin och tymidinkoncentration påverkar signifikant minskningen av inhiberingshalogenerna av sulfonamider och trimetoprim.

-Höga halter av kalcium och magnesium ger falskt motstånd av aminoglykosider, polymyxin B och tetracykliner mot stammar av Pseudomonas aeruginosa.

-Låga koncentrationer av kalcium och magnesium ger falska känsligheter av aminoglykosider, polymyxin B och tetracykliner mot stammar av Pseudomonas aeruginosa.

-Närvaron av zink påverkar resultaten av karbapenemsskivorna (imipenem, meropenem och ertapenem).

-Medelns tjocklek under 3 mm ger felaktiga känslighetsresultat, medan en tjocklek över 5 kommer att ge falskt motstånd.

-Mobiliseringen av skivor i antibiogrammet kommer att ge deformerade halon, eftersom antibiotikumutmatningen är omedelbar.

- Mycket svaga inokulum påverkar resultaten, eftersom det inte finns någon enhetlig eller sammanflyttad tillväxt i agar, ett nödvändigt villkor för att kunna mäta inhiberingszoner, förutom att halonerna kan ge större än normalt.

-Överbelastad inokul kan ge halor mindre än normalt.

-Om du inte respekterar avståndet mellan skivor får en halo att överlappa en annan och kan inte läsas korrekt.

-Inkubera med CO₂ ökar storleken på halterna av tetracyklin och meticillindiskar.

-Inkubation vid temperaturer under 35 ° C ger större halor.

-Tillsatsen av blod minskar sulfonamidernas halo-storlek.

begränsning

Känsligheten hos ett antibiotikum demonstreras i antibiogrammet mot en mikroorganism (in vitro) är ingen garanti för att det kommer att fungera in vivo.

Kvalitetskontroll

För att veta om mediet innehåller rätt mängd tymin, bör en stam säljas av Enterococcus faecalis ATCC 29212 och testa mottagligheten för trimetoprimsulfametoxazol (SXT), den ska ge en halo lika med eller> 20 mm för att vara tillfredsställande.

referenser

1. "Agar Müller-Hinton." Wikipedia, den fria encyklopedin. 16 november 2018, 12:23 UTC. 27 jan, 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologisk diagnos av Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
3. Cona E. Villkor för en bra mottagningsstudie med agar diffusionstest. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratory. Müeller Hinton agar med 5% fårblod. 2009. Tillgänglig på: http://f-soria.es
5. BD Müeller Hinton II agarlaboratorium. 2017. Finns på: .bd.com
6. Laboratorier Britania. Müeller Hinton agar. 2015. Finns på: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnos. 5: e upplagan. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
8. Martínez-Rojas D. Betalactamasas typ AmpC: Allmänt och metoder för fenotypisk detektion. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Finns på: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotypisk detektering av metallobetalaktamaser i kliniska isolat av Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Finns på: scielo.org.