DNA-sekvensering Maxam-Gilbert, Sanger-metod, exempel



den DNA-sekvensering (deoxiribonukleinsyra) är ett förfarande som utförs i molekylärbiologilaboratorier som gör det möjligt att känna till nukleotidernas ordning i det genetiska materialet av intresse. Dessutom kan sekvenseringen av RNA (ribonukleinsyra) också avslöjas.

Denna teknik har varit oumbärlig för utvecklingen av biologiska vetenskaper. Det gäller även andra kunskapsområden - till exempel medicinsk diagnos och kriminalteknisk undersökning.

Tidigare betraktades sekvenseringen av en DNA-sträng som en långsam och dyr aktivitet, som möjliggjorde identifiering av endast några få baspar i oligonukleotiderna.

Idag, med alla framsteg inom vetenskapen, är DNA-sekvensering en rutinmässig operation i många laboratorier världen över tack vare bidraget från nästan 50 års forskning på detta område. När det gäller längden på kedjan kan du sekvens upp till miljontals baspar på en mycket kort tid.

För att göra det finns det dussintals utvecklade tekniker som varierar i pris och noggrannhet. I denna artikel kommer vi att beskriva både klassiska och moderna tekniker, var och en med sina fördelar och nackdelar.

Hittills tillåter sekvenseringsteknikerna att erhålla sekvensen av fullständiga genomer, från små prokaryoter och jäst till det humana genomet.

index

  • 1 struktur av DNA
  • 2 historia
  • 3 Sångermetod
    • 3.1 Huvudkomponenterna i reaktionen
    • 3.2 Läsa resultaten
  • 4 Automatisk sekvensering
  • 5 Maxam-Gilbert-sekvensering
    • 5.1 Förfarande
    • 5.2 Läsa resultaten
  • 6 Massiv sekvensering
    • 6.1 Pyrosequencing
    • 6.2 Sekvensering genom syntes
    • 6.3 Sekvensering genom ligering
    • 6.4 Sequencing Ion Torrent
  • 7 Exempel
    • 7.1 Sekventeringen av det humana genomet
  • 8 Betydelse och tillämpningar
  • 9 referenser

Struktur av DNA

För att förstå de metoder och tekniker som används för DNA-sekvensering är det nödvändigt att känna till vissa nyckelaspekter av molekylens struktur och sammansättning.

DNA är en biomolekyl som finns i alla levande saker, från bakterier till stora vattenlevande djur. Organeller - som mitokondrier och kloroplaster - har en cirkulär DNA-molekyl inuti dem. Även i vissa virus är det genetiska materialet som finns DNA.

Strukturellt är DNA en uppsättning nukleotider. Var och en är integrerad med en kolhydrat, en kvävebas (A, T, C eller G) och en fosfatgrupp. Målet med DNA-sekvensering är att avslöja den ordning i vilken de fyra kvävebaserna finns i sekvensen.

historia

I mitten av 1950-talet beskrev forskare Watson och Crick strukturen av DNA med hjälp av kristologiska tekniker. Ingen av dessa forskare hade emellertid kunnat hitta ett sätt att avtäcka sekvensen.

Även om det fanns några föregångare, den viktigaste händelsen var skapandet av Sånger-metoden, 1977. Frederick Sanger, far till metoden var en brittisk biokemist, vinnare av två Nobelpris för sina enorma bidrag till de biologiska vetenskaperna.

Denna teknik är också känd i litteraturen som "kedjestoppning" eller dideoxynukleotider. Därefter kommer vi att beskriva principerna för denna teknik och de som utvecklats utifrån förbättringen och innovationen av detta.

Sångers metod

Utvecklingen av Sanger-metoden var en viktig händelse inom molekylärbiologi. Det involverar de grundläggande komponenterna i DNA-replikationsprocessen som vanligen förekommer i cellen, men genom att lägga till en särskild komponent: dideoxynukleotider.

Huvudkomponenterna i reaktionen

- DNA-polymeras: enzymet DNA-polymeras är ett avgörande element i processen. Denna molekyl deltar i replikationen av DNA-strängen och dess roll är syntesen av den nya kedjan, som matchar deoxiribonukleotiderna trifosfatet med de komplementära.

Påminna om att DNA-tymin (T) passa ihop med adeniner (A) till två vätebindningar, medan cytosin (C) bildar med guanin (G) genom tre broar.

- Nukleotider Sanger-sekvensering involverar två typer av nukleotider, 2'-deoxinukleotider fyra (förkortat som dATP, dGTP, dTTP och dCTP) och de fyra dideoxinukleotider (ddATP, ddGTP, ddCTP och ddTTP) Special.

Fastän dideoxynukleotider liknar de monomerer som normalt införlivas i DNA saknar de en -OH-grupp i sin struktur. Detta gör det omöjligt att lägga till en ny nukleotid i kedjan.

När en särskild nukleotid tillsätts - på ett fullständigt slumpmässigt sätt - till kedjan i bildning, är därför syntesen förlamad. På detta sätt, i slutet av reaktionen, finns det kedjor av olika storlekar, var och en där reaktionen stoppades vid en annan punkt.

Experimentellt utarbetas fyra försök. Varje innehåller DNA extraherat från det biologiska provet av intresse, de normala nukleotiderna och en av de fyra typerna av speciella nukleotider. Eller de speciella nukleotiderna är märkta med någon typ av fluorescerande markör (se nedan automatiserad sekvensering).

Läsning av resultaten

Det första steget är att skilja var och en av de syntetiserade kedjorna efter deras storlek. Vissa kommer att vara längre än andra, beroende på var de särskilda baserna införlivades.

Det finns olika biokemiska tekniker som tillåter separation av komponenterna i en blandning med användning av storleken som en diskriminerande egenskap. I Sanger-metoden separeras de olika kedjorna med elektrofores. I de mest sofistikerade varianterna av tekniken används kapillärelektrofores.

Således rör de längre strängarna mindre än de kortare varianterna. Därefter går systemet genom en läsare som känner igen markören som ingår i varje dideoxynukleotid. På så sätt kan sekvensens ordning vara känd.

Denna "första generationens" teknik kan läsa DNA-fragment som inte är större än 1 kilobas. För närvarande används Sanger metod i flera laboratorier, vanligtvis i sina moderna varianter. Dessutom används det för att bekräfta resultaten som erhållits med de mest komplexa teknikerna - men mindre exakta.

Automatisk sekvensering

När storskalning krävs är processen accelererad genom automatisering. Det här är en variation av Sanger-kedjans avslutningsmetod där primerna är märkta med fluorescerande produkter för att skilja dem.

Därefter körs produkten av reaktionen i en elektrofores - allt i en enda lane. När varje fragment lämnar den slutliga delen av gelén identifieras den snabbt av dess fluorescerande etikett med ett fel som omger 1%.

De mest sofistikerade systemen har ett system med upp till 96 kapillärrör som drivs av en dator kopplad till en robot. Det vill säga 96 DNA-prover kan utvärderas samtidigt. Således är processen som involverar elektrofores och analysen av resultaten fullständigt automatiserad.

På en dag kan dessa system sekvensera upp till 550 000 baser. Under processen är mänskligt arbete onödigt, det tar bara cirka 15 minuter att starta metoden.

Sequencing av Maxam-Gilbert

Samtidigt som Sanger publicerade sitt arbete lyckades två forskare som heter Allan Maxan och Walter Gilbert utveckla en annan metod för att erhålla DNA-sekvensen. Metoden blev populär vid den tiden, men förskjutits senare av förbättringen av Sanger-metoden.

I motsats till Sanger-metoden innebär sekvenseringen av Maxan och Gilbert (eller kemisk sekvensering, som det också är känt) inte hybridiseringsreaktioner. Metoden består av märkning med reaktiva medel i ena änden, följt av en reningsprocess.

En av de negativa aspekterna av denna teknik ligger i dess enorma komplexitet och användningen av kemikalier som är farliga för användaren. Kemiska nedbrytningar induceras genom applicering av DMS, myrsyra, hydrazin och hydrazin med salter.

process

Protokollet börjar med märkningen vid 5'-änden av strängen med fosformarkören 32, då sker en kemisk modifiering av den kvävebaserade basen och den separeras. Slutligen uppstår splittringen av den abasiska regionen.

Först förkortas kedjan som ska sekvenseras i mindre segment. Detta steg utförs med restriktionsenzymer, vilket resulterar i enastående extremiteter.

Därefter utförs reaktionen med ett alkaliskt fosfatas, vars syfte är att eliminera fosfatgruppen. Således kan ett polynukleotidkinas användas för att utföra märkningen.

Kedjan denatureras (de båda trådarna är öppna). Sedan fortsätter vi att applicera kemikalierna. Dessa klyvningsreaktioner görs på ett kontrollerat sätt och vilka typer av bindningar bryts av varje applicerad kemikalie.

Läsning av resultaten

Som i Sanger-metoden innebär läsningen av resultaten separeringen av storleken av kedjorna erhållna i ett elektroforesystem. Systemen som består av polyakrylamid möjliggör en mycket adekvat upplösning för att läsa gelén.

Massiv sekvensering

Massiv sekvensering omfattar en serie nya metoder, förkortade som NGS, från engelska "Nästa generationssekvensering ".

Metoderna som är katalogiserade som NGS kräver ett tidigare steg med DNA-amplifiering (de fungerar inte med en enda molekyl). Dessutom varierar de använda plattformarna mycket. Principerna för de mest populära metoderna kommer att beskrivas nedan:

pyrosekvensering

Det innefattar övervakning av frisättningen av ett pyrofosfat, som uppträder varje gång en ny nukleotid tillsätts till DNA-strängen. Ett enzymsystem är kopplat, så att ljusutsläpp (som detekteras av en kamera) inträffar varje gång en ny nukleotid införlivas.

Processen börjar med separat inkubering av varje kvävebas för att verifiera huruvida det finns ljusutsläpp eller ej. Pyrosequencing kan utföra avläsning av långa strängar, men den konstaterade felfrekvensen är hög.

Sekvensering genom syntes

Detta involverar införlivandet av märkta nukleotider. Dessa fluorescerande komponenter tillsätts, tvättas och den införlivade nukleotiden noteras. Därefter elimineras nukleotidmärkning och syntesen av strängen kan fortsätta. I nästa steg kommer också en märkt nukleotid att inkorporeras, och de nämnda stegen kommer att upprepas.

En nackdel med denna teknik uppstår när fluorescerande markörer inte elimineras fullständigt. Dessa utsläpp skapar bakgrundsfel, vilket resulterar i signifikanta fel.

Sekvensering genom ligering

Denna teknik varierar från de andra, eftersom den inte använder DNA-polymeras. Istället är nyckel enzymet för denna metod ligas. Här används DNA-fragment som fluoresceras märkta, är bunden av enzymet och detekteras.

Det största problemet med denna teknik är den mycket korta längden av fragment som kan bearbetas.

Ion Sequencing Torrent

Denna teknik är baserad på mätningen av H-jon+ som frisätts varje gång en ny nukleotid införlivas. Principen är ganska lik pyrosequencing, men mycket billigare.

exempel

Sekvenseringen av det humana genomet

Sequencing genomet av människor har varit en av de mest lovande utmaningarna i biologi, liksom att vara en av de mest hyllade rivaliteterna i vetenskapens historia. Faktum är att för de forskare som är involverade i projektet blev sekvensering genomet en konkurrens.

1990 började han det som kallades "mänskligt genomprojekt", ledt av den berömda vetenskapsmannen, vinnaren av Nobelpriset, James Watson. Efter ett år, 1991, tar Venter utmaningen att "slå" Watson och sekvensera genomet före honom. Men år 1992 avbröt Watson och kommandot togs av en annan forskare.

År 1995 tillkännagav Venter sin framgång i den fullständiga sekvenseringen av ett bakteriegen genom den slumpmässiga sekvenseringsmetoden. På samma sätt tillkännagav det motsatta laget ett år senare sekvenseringen av jästgenomet.

År 2000 avslutades loppet. Båda företagen publicerade sina preliminära resultat av det fullständiga genomet i två av de mest prestigefyllda vetenskapliga tidskrifterna: Nature och Science.

Men forskarna fortsatte arbetet med att förbättra förslagen, och under 2006 avslutades sekvenserna vissa mänskliga kromosomer.

Betydelse och tillämpningar

Att veta ordningen av nukleotiderna av en molekyl lika viktig som DNA är värdefull för biologer och relaterade proffs. Denna kedja av polynukleotider innehåller all information som är nödvändig för utveckling och underhåll av alla livsformer.

Av dessa skäl är kunskap om denna sekvens väsentlig för biologisk forskning. Grundläggande tillåter sekvensering oss att mäta en av de viktigaste egenskaperna hos biologiska system och att fastställa skillnader mellan dem.

Sekvensering används i stor utsträckning av taxonomer och systematiker, eftersom vissa DNA-sekvenser tillåter fastställande av kriterier för att avgöra om två organismer hör till samma art eller ej, samt att kunna föreslå hypoteser om de fylogenetiska relationerna mellan dem..

Dessutom har DNA-sekvensering tillämpningar inom medicin och diagnostik. Till exempel finns det prisvärda och tillgängliga system som genom sekvensering tillåter oss att utvärdera tendensen att utveckla vissa sjukdomar (som cancer) med hjälp av de så kallade enkla nukleotidpolymorfismerna (SNP)..

Undersökningarna av den kriminaltekniska och rättsmedicinska typen har också berikats med sekvenseringsteknikerna och kan användas som tillförlitliga bevis för att en viss individ deltar i ett brott.

referenser

  1. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Sekvensen av sekvenser: historien av sekvenserings-DNA. Genomics, 107(1), 1-8.
  2. Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. (2013). Nästa generations sekvenseringsrevolution och dess inverkan på genomik. cell, 155(1), 27-38.
  3. Levy, J. (2010). Vetenskapliga rivaliteter. Från Galileo till det mänskliga genomprojektet. Paraninfo Editorial.
  4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A.R. (1977). DNA-sekvensering med kedjestoppande inhibitorer. Förfarandena vid den nationella vetenskapsakademin, 74(12), 5463-5467.
  5. Schuster, S.C. (2007). Nästa generations sekvensering förvandlar dagens biologi. Naturmetoder, 5(1), 16.
  6. Xu, J. (Ed.). (2014). Nästa generations sekventering. Caister Academic Press.