Proteinas K egenskaper, enzymatisk aktivitet och applikationer

den proteinas K är ett enzym som hör till gruppen av serinproteaser, dvs den har i sin mitt ett katalytiskt aktiv aminosyra serin och har funktionen att bryta peptidbindningarna genom hydrolys. I sin tur hör detta enzym till familjen av proteiner subtilisiner (peptidas S8).

Proteinas K har en molekylvikt (MW) av 28 900 dalton och isolerades för första gången 1974 från extrakt av svampen Engyodontiumalbum, tidigare känt genom namnet på Tritirachium-album Limber.

Det uppvisar en hög proteolytisk kapacitet, som demonstreras för att kunna försämra det närvarande keratinet i håret. Ordet keratin på engelska är skrivet "keratin", varför det har kallats "proteinas K".

På grund av sin höga kapacitet att klyva in native proteiner är detta enzym användbart i olika molekylärbiologitekniker. Det används huvudsakligen för att isolera och förbereda nukleinsyror med hög molekylvikt (MW).

Proteinas K verkar för att frigöra den nukleärt DNA, medan förstöra proteiner och inaktiverar RNaser och DNaser, dvs eliminerar nukleas i preparat av DNA och RNA.

Dessutom har det visat sig att proteinas K kan hydrolysera vissa denaturerade nativt protein, vilket har väckt intresset hos forskare för användning i studien av prionproteiner (PrP).

Emellertid, trots dess höga potens existerar proteolytiska proteiner som är resistenta mot verkan av proteinas K. Bland dem vissa onormala proteiner som kallas prioner (PrP ^ '^) som hör samman med TSE är.

index

• 1 Egenskaper av proteinas K
• 2 Enzymatisk aktivitet
• 3 applikationer
• 4 Fördelar med proteinas K
• 5 Proteinasresistenta proteiner K
• 6 referenser

Egenskaper hos proteinas K

Proteinas K har en tertiär struktur bildad av tre skikt, med ett p-ark med sju kedjor mellan varandra skilda mellan två skikt av spiraler. Hör till familjen av peptidas S8 kännetecknas av dess aktiva ställe i en katalytisk triad, vars sekventiell ordning är (Asp, His och Ser), som särskiljer dem från andra familjer peptidas.

Detta enzym från gruppen av serinproteaser karakteriseras genom hydrolysering av peptidbindningarna nära karboxylgruppen hos de alifatiska och aromatiska aminosyrorna.

Dessutom är det kan agera i närvaro av vissa korrosiva, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), Tris-HCl och EDTA, som används för att hjälpa den denaturering av proteiner, vilket får dem att förlora sina nativa struktur ämnen.

Detta är ett preliminärt steg vid framställning av proteiner för elektrofores-tekniken. PH-intervallet vid vilket proteinas K verkar är ganska bred (2,0 till 12,0), med ett optimalt pH mellan 7,5 och 12,0 och dess isoelektriska punkt är 8,9. Som kan observeras är den aktiv mot ett mycket brett spektrum av pH.

En annan egenskap som uppträder i proteinas K är dess stabilitet i närvaro av höga temperaturer (50-60 ° C).

Enzymatisk aktivitet

Proteinas K behöver närvaron av kalciumjon, även om detta inte påverkar dess aktivitet om det är nödvändigt att bibehålla stabiliteten.

För proteinas K att utföra fullständig digestion av substratet är en ungefärlig kontakttid på mellan 5 och 2 timmar nödvändig.

Emellertid, i detta avseende Daza et al jämförde renheten av DNA som erhållits flera exponeringstider mot proteinas K, och drog slutsatsen att förlängd inkubation (upp till 24 h) signifikant förbättrar kvaliteten av DNA.

Nu, i förhållande till den koncentration som används av proteinas K-enzymet i de olika protokollen kan det sägas att det är mycket varierat.

Den kan användas från mycket låga koncentrationer (5 μg / ml) till koncentrationer av 500 μg / ml. Men de vanligaste arbetskoncentrationerna varierar mellan 50-100 μg / ml, speciellt för proteindeltning och nukleasinaktivering. Även om en koncentration på 2 mg / ml krävs för vävnadsbehandling.

tillämpningar

Dess tillämpningar är mycket breda och kan sammanfattas i följande:

-Det används i nedbrytning av proteiner och DNA extraktionsmetoder som är flera: utsaltning, PK-SDS, cetyltrimetylammoniumbromid ammoniumbromid (CTAB), och kaliumacetat modifierad extraktion med natriumjodid.

-Inaktivering av nukleaser (RNaser och DNaser).

-I hybridiseringstekniken in situ (HIS), för att hjälpa till att frigöra nukleinsyran, förutom att eliminera oönskade proteiner.

-Protein modifiering.

-På forskarnivå, i olika studier.

Fördelar med proteinas K

Flera jämförande studier har gjorts bland DNA-extraktionstekniker med Proteinase K, med andra som inte använder det och alla slutsatsen att det finns större fördelar vid användning av enzymet. Bland fördelarna kan följande nämnas:

-DNA med hög molekylvikt av hög kvalitet och renhet erhålls.

-Det extraherade DNAet är stabilt upp till 3 månader.

Det extraherade DNA kan användas i följande tekniker: Southern blot, polymeras-kedjereaktion (PCR), elektrofores, bland andra.

Proteiner som är resistenta mot proteinas K

Forskning har dragit slutsatsen att prioner (PrP ^ '^ toxisk onormala proteiner) är differentierade från PrPc proteiner (nativa) för att vara resistent mot verkan av proteinas K, medan PrPC är känsliga för verkan.

Andra författare har beskrivit att i strukturen av PrPSc finns känsliga delar och andra resistenta mot proteinas K. Båda delarna är emellertid lika giftiga och infektiva..

Å andra sidan isolerade Bastian och medarbetare 1987 4 proteiner med 28, 30, 66 och 76 kda från en art av Spiroplasma mirum. Alla var resistenta mot verkan av proteinas K och hade också en korsreaktion med några prioner.

Det är känt att denna art kan orsaka grå starr och betydande neurologiska skador och på grund av vetenskapliga rön Bastian, bland annat forskning har försökt att länka till denna mikroorganism med transmissibla spongiforma encefalopatier.

Emellertid är etiologin för denna degenerativa neurologiska patologi fortfarande beroende av prioner idag.

I denna mening identifierade Butler och medarbetare 1991 och karakteriserade en klass av 40 Kda proteinasresistent protein K från två stammar av Mykoplasma hyorinis. Denna patogen påverkar grisarna, infekterar sina vävnader, men i detta fall fanns ingen korsreaktion med de testade prionerna.

Mer forskning behövs för att belysa många okända om det.

referenser

1. Bastian F, Jennings R och Gardner W. 1987. Antiserum till scrapieassocierat fibrilprotein korsreagerar med Spiroplasma mirum fibrilproteiner. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Utvärdering av en DNA-extraktions- och reningsmetod från muskelvävnad fixerad i formaldehyd från oidentifierade kadaver.  Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, M Frick, Evancho S, Stanbridge E, Och McGarrity G. Identifiering och karakterisering av proteinas K-Resistenta Proteiner i Medlemmar av klassen Mollicutes. Infektion och immunitet, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Jämförelse av två protokoll för extrahering av DNA från Trypanosoma cruzi odlas i axeniskt medium. Rev. Peru. Med. Exp. Folkhälsa  2014; 31 (2): 222-227. Finns på: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E och Palma W. Bestämning av effektiviteten hos fem DNA-extraktionsprotokoll från paraffinmaterial för molekylära studier. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.