Restriktionsenzymer fungerar, verkningsmekanism, typer och exempel



den restriktionsenzymer Du är endonukleaser som används av vissa arkéer och bakterier att hämma eller "begränsa" spridningen av virus inuti. De är särskilt vanliga hos bakterier och ingår i deras försvar mot främmande DNA som kallas restriktion / modifieringssystemet.

Dessa enzymer katalyserar skärningen av dubbelsträngat DNA vid specifika ställen, reproducerbart och utan användning av ytterligare energi. De flesta kräver närvaron av kofaktorer, såsom magnesium eller andra divalenta katjoner, även om vissa också kräver ATP eller S-adenosylmetionin.

Restriktionsendonukleaser upptäcktes 1978 av Daniel Nathans, Arber Werner och Hamilton Smith, som fick Nobelpriset för medicin för deras upptäckt. Dess namn härstammar vanligen från organismen där de observeras för första gången.

Sådana enzymer används i stor utsträckning vid utvecklingen av DNA-kloningsmetoder och andra molekylärbiologi och genteknikstrategier. Dess egenskaper för erkännande av specifika sekvenser och förmåga att skära sekvenser nära igenkänningsställen gör dem kraftfulla verktyg i genetiskt experiment.

Fragmenten som genereras av restriktionsenzymer som har agerat på en viss DNA-molekyl kan användas för att återskapa en "karta" av den ursprungliga molekylen genom att använda information om där enzymet skär DNA.

Vissa restriktionsenzymer kan ha samma igenkänningsplats i DNA, men de skär inte nödvändigtvis det på samma sätt. Således finns enzymer som gör skaror som lämnar stumma ändar och enzymer som skär sönder sammanhängande ändar, vilka har olika tillämpningar inom molekylärbiologi.

För närvarande finns hundratals olika kommersiellt tillgängliga restriktionsenzymer, som erbjuds av olika kommersiella hus; Dessa enzymer fungerar som "anpassade" molekylära saxar för olika ändamål.

index

  • 1 Funktioner
  • 2 Handlingsmekanism
  • 3 typer
    • 3.1 Typ I-restriktionsenzymer
    • 3.2 Typ II-restriktionsenzymer
    • 3.3 Typ III restriktionsenzymer
    • 3.4 Typ IV restriktionsenzymer
    • 3,5 typ V restriktionsenzymer
  • 4 exempel
  • 5 referenser

funktioner

Restriktionsenzymer utför den motsatta funktionen av polymeraser, eftersom dessa hydrolysera eller bryta esterbindningen i fosfodiesterbindningen mellan angränsande nukleotider i en nukleotidkedja.

I molekylärbiologi och genteknik är de allmänt använda verktyg för konstruktion av uttrycks- och kloningsvektorer, såväl som för identifiering av specifika sekvenser. De är också användbara för konstruktionen av rekombinanta genomer och har stor bioteknisk potential.

Senaste framstegen inom genterapi göra gemensam användning av restriktionsenzymer för insättning av gener som bestäms i vektorer som är fordon för transport av sådana gener i levande celler, och förmodligen har förmåga att sättas in i det cellulära genomet för permanenta förändringar.

Verkningsmekanism

Restriktionsenzymer kan katalysera skärningen av dubbelsträngat DNA, fastän vissa kan känna igen enkelsträngade DNA-sekvenser och jämn RNA. Skärningen sker efter sekvensens igenkänning.

Verkningsmekanismen består i hydrolys av fosfodiesterbindningen mellan en fosfatgrupp och en deoxiribos i ryggraden i varje DNA-sträng. Många av enzymerna kan skära på samma plats som de känner igen, medan andra skär mellan 5 och 9 par baser före eller efter det..

Normalt dessa enzymer skurna vid 5 'änden fosfatgrupp, resulterande DNA-fragmenten med en fosforyl 5'-änden och ett hydroxyltal ände 3' terminal.

Eftersom proteiner inte kommer i direkt kontakt med webbplatsen erkännande i DNA: t, bör de translokerar successiva gånger tills den specifika platsen, kanske genom att "skjuta" mekanismer på DNA-strängen.

Under den enzymatiska skuren placeras fosfodiesterbindningen av var och en av DNA-strängarna inom en av de aktiva ställena i restriktionsenzymerna. När enzymet lämnar igenkännandet och skärplatsen gör det det genom icke-specifika övergående föreningar.

Typ

För närvarande är fem typer av restriktionsenzymer kända. Nedan följer en kort beskrivning av var och en av följande:

Typ I restriktionsenzymer

Dessa enzymer är stora pentameriska proteiner med tre subenheter, en restriktion, en metylering och en annan för igenkänning av sekvenser i DNA. Dessa endonukleaser är multifunktionella proteiner med förmåga att katalysera restriktions- och modifieringsreaktioner, de har ATPasaktivitet och även DNA-topoisomeras.

Enzymer av denna typ var de första att upptäcka endonukleaser, renas för första gången på 1960-talet och har sedan dess studerats i stort djup.

Typ I enzymer inte så vanligt som en bioteknisk verktyg, eftersom klyvningsstället kan vara ett variabelt avstånd upp till ca 1000 baspar igenkänningsstället, vilket gör dem opålitliga som experimentell reproducerbarhet.

Typ II restriktionsenzymer

De är enzymer som består av homodimerer eller tetramerer som skär DNA på bestämda platser mellan 4 och 8 bp i längd. Dessa skärplatser är typiskt palindromiska, det vill säga de känner igen sekvenser som läses på samma sätt i båda riktningarna.

Många av typ II-restriktionsenzymerna i bakterier skär DNA när de känner igen sin främmande karaktär, eftersom de inte har de typiska modifieringar som eget DNA borde ha..

Dessa är de enklaste restriktionsenzymerna eftersom de inte kräver någon annan kofaktor än magnesium (Mg +) för att känna igen och skära DNA-sekvenserna.

Noggrannheten av typ II-restriktionsenzymer vid identifiering och skärning av enkla sekvenser i DNA i exakta positioner gör dem till en av de mest använda och oumbärliga i de flesta grenar av molekylärbiologi.

Inom gruppen av typ II är restriktionsenzymer flera underklasser klassificerade enligt vissa egenskaper som är unika för var och en. Klassificeringen av dessa enzymer görs genom att lägga till bokstäver i alfabetet, från A till Z efter enzymmets namn.

Några av de underklasser som är mest kända för deras användbarhet är:

Underklass IIA

De är dimerer av olika underenheter. De känner igen asymmetriska sekvenser och används som ideala prekursorer för generering av skärande enzymer.

Underklass IIB

De är sammansatta av ytterligare en dimer och skär DNA: n på båda sidor av igenkänningssekvensen. De skär båda DNA-strängarna i en rad baspar utöver igenkänningsstället.

Underklass IIC

Enzymer av denna typ är polypeptider med funktioner för uppdelning och modifiering av DNA-strängar. Dessa enzymer skär båda strängarna asymmetriskt.

Underklass IIE

Enzymerna i denna underklass är de mest använda inom genteknik. De har en katalytisk plats och kräver generellt en allosterisk effektor. Dessa enzymer måste interagera med två kopior av deras igenkänningssekvens för att göra en effektiv nedskärning. Inom detta underklass är enzymerna EcoRII och EcoRI.

Typ III restriktionsenzymer

Typ III-restriktionsendonukleaser är sammansatta av endast två subenheter, en är ansvarig för DNA-igenkänning och modifiering, medan den andra är ansvarig för att skära sekvensen.

Dessa enzymer kräver två kofaktorer för deras funktion: ATP och magnesium. Restriktionsenzymer av denna typ har två asymmetriska igenkännings translokera DNA ATP-beroende sätt och skars mellan 20 till 30 bp intill igenkänningsstället.

Typ IV restriktionsenzymer

Typ IV-enzymer är lätta att identifiera eftersom de skär DNA med metyleringsmarkörer, de består av flera olika underenheter som är ansvariga för att identifiera och skära DNA-sekvensen. Dessa enzymer använder som cofaktorer GTP och divalent magnesium.

Specifika ställen för skärning innefattar nukleotidkedjor med rester av metylerad eller hydroximetylerad cytosin i en eller båda strängarna av nukleinsyror.

Typ V restriktionsenzymer

Denna klassificering grupperar enzymerna CRISPER-Cas-typ, vilka identifierar och skär specifika DNA-sekvenser från invaderande organismer. Cas-enzymer använder en sträng av CRISPER-syntetiserad styrande RNA för att känna igen och attackera invaderande organismer.

Enzymer klassificerade som typ V är polypeptider strukturerade av typ I, II och II enzymer. De kan skära delar av DNA i nästan vilken organism som helst och med ett stort antal längder. Dess flexibilitet och användarvänlighet gör dessa enzymer ett av de verktyg som används oftast inom gentekniken nu tillsammans med typ II-enzymer.

exempel

Restriktionsenzymer har använts för att detektera DNA-polymorfismer, särskilt i populationsgenetiska studier och evolutionära studier med användning av mitokondrie-DNA, för att få information om priser nukleotidsubstitutioner.

För närvarande har vektorerna som används för transformation av bakterier med olika syften multikloningsställen där igenkänningsställen för multipla restriktionsenzymer finns..

Bland dessa enzymer är de mest populära EcoRI, II, III, IV och V, som erhållits och beskrivits för första gången E. coli; HindIII, från H. influenzae och BamHI s B. amyloliquefaciens.

referenser

  1. Bickle, T. A., & Kruger, D.H. (1993). Biologi av DNA-begränsning. Mikrobiologiska recensioner, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., & Horvath, P. (2007). CRISPR Ger förvärvat motstånd mot virus i prokaryoter. Science, 315(Mars), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Det molekylära perspektivet: Restriktionsendonukleaser. Stamceller Grundämnen för cancermedicin, 20, 190-191.
  4. Halford, S.E. (2001). Hopping, hoppning och looping av restriktionsenzymer. Biochemical Society Transactions, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Underhåll av artidentitet och kontroll av bakteriernas speciering: En ny funktion för restriktioner / modifieringssystem? gen, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewins gener XII (12 red.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... Hon, Q. (2015). Harnessing Type I och Type III CRISPR-Cas-system för genomredigering. Nukleinsyraforskning, 1-12.
  8. Loenen, W. A. ​​M., Dryden, D. T. F., Raleigh, E.A., och Wilson, G. G. (2013). Typ I restriktionsenzymer och deras släktingar. Nukleinsyraforskning, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restriktionsendonukleaser vid analys och omstrukturering av DNA-molekyler. Annu. Rev. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., & Tajima, F. (1981). DNA-polymorfism detekterbar genom restriktionsendonukleaser. Genetics, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Cellulära och molekylära livsvetenskaper Type II-restriktionsendonukleaser: struktur och mekanism. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Hur restriktionsenzymer blev arbetshästar i molekylärbiologi. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R.J., och Murray, K. (1976). Restriktionsendonukleaser. Kritiska recensioner i biokemi, (November), 123-164.
  14.  Stoddard, B. L. (2005). Homing endonukleasstruktur och funktion. Kvartalsvisa recensioner av biofysik, 1-47.
  15.  Tock, M. R., & Dryden, D. T. F. (2005). Biologin av restriktion och anti-restriktion. Nuvarande yttrande inom mikrobiologi, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G.G., & Murray, N.E. (1991). Begränsnings- och modifieringssystem. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genomiska insikter i Campylobacter jejuni virulens och populationsgenetik. Infect. Dis. Övers. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Struktur och mekanism för multifunktionella restriktionsendonukleaser. Annu. Rev. Biochem., 50, 285-315.