Bakteriella smältegenskaper och beredning
den bakteriell smet är en förlängning i form av en tunn film av en suspension av bakteriella mikroorganismer som utförs på en transparent glasplatta eller -glas, för observation under ett optiskt mikroskop.
Förlängningen i form av film utförs för att separera mikroorganismerna så mycket som möjligt, för om de är grupperade är observationen inte tydlig.
I studien av bakteriekulturer används tekniker för smearpreparation, fixering och färgning för att analysera dem bättre. På grund av mikroorganismens lilla storlek krävs det nödvändigtvis att man använder ett optiskt mikroskop för observation.
De optiska mikroskikten är oumbärliga instrument för observation av utstrykningarna. Dessa använder optiska linser och ljus vilket möjliggör visualisering av proverna med stor ökning i storlek.
I allmänhet har levande celler inte strukturer som mestadels är färgade, sedda genom det optiska mikroskopet är de färglösa, genomskinliga prov och visar mycket liten intern kontrast och med omgivningen.
Observationen med det enkla ljusfältmikroskopet, utan användning av hjälpfärgningstekniker, är mycket begränsat och används endast i vissa fall, som i observationen av rörelsen av mikroorganismer.
För att observera mikroorganismer optimalt måste en balans mellan kontrast och upplösning uppnås. Detaljerna hos cellerna kan inte observeras under ett mikroskop, även vid hög upplösning; användningen av färgämnen krävs genom färgningstekniker som ger kontrast för observation.
index
- 1 Egenskaper för en bra bakterie smält
- 1.1 Utmärkt kontrast
- 1.2 Bra fix
- 1.3 Bra färgning
- 2 Framställning
- 2,1 A. Frotis
- 2.2 B. Fixering
- 2.3 C. Enkel färgning
- 2.4 D. Slutlig bevarande av smeten
- 3 referenser
Kännetecken för en bra bakterie smält
Utmärkt kontrast
För att uppnå en utmärkt kontrast kallas sofistikerade mikroskop faskontrastmikroskop, differentialinterferens och mörkt fältmikroskop. Denna typ av mikroskop används för att observera bakteriestrukturer såsom mantlar och trådar, bland andra.
Staining är en enkel teknik för att öka kontrasten som uppnås med ett tydligt fältmikroskop. I denna teknik kan olika färgämnen användas som märkbart förbättrar observationen under mikroskopet.
Fläckarna görs direkt på smutsarna eller förlängningarna av suspensionerna av mikroorganismer på glidbanorna, som tidigare torkats och fixerats.
Bra fix
Fixering är en teknik som används för att bevara cellulära strukturer; orsakar inaktivering av mikroorganismerna och vidhäftning till glidglaset. Det finns olika fixeringsbehandlingar: värmefixering och kemisk fixering.
Värmefixering
Detta är den metod som används mest vid observation av bakteriell smet. Tekniken består i att passera bakteriesuspensionen av smetet genom en tändares låga. Denna teknik kan bevara bakteriens yttre morfologi, men förstör deras inre strukturer.
Kemisk fixering
Kemisk fixering använder kemikalier vid bevarande, bland annat formaldehyd eller formaldehyd, etanol och ättiksyra. Fördelen med att använda kemiska fixeringsmedel är att bevarandet av de interna cellulära strukturerna hos mikroorganismerna uppnås.
Bra färgning
De vanligaste förfarandena för färgning av ett tidigare torkat och fixerat smärta är positiv eller enkel färgning, differentiell färgning och negativ färgning. Det finns också speciella tekniker för färgning av speciella cellstrukturer (kapsel, spore, flagella).
Positiv färgning eller enkel färgning
Positiv eller enkel färgning är den mest använda fläckfärgstekniken. Använder färgämnen som har förmåga att binda till vissa mikrobiella strukturer, så att de kan observeras under ett mikroskop.
Dessa färgämnen har kromoforiska grupper (färgad del) i sin kemiska struktur, med alternerande dubbelbindningar och enkla bindningar (konjugation). Dessa bindningar kan i sin tur etablera joniska eller kovalenta bindningar med vissa cellulära strukturer.
Färgämnena som används i positiv eller enkel färgning är mestadels kemiska derivat av anilin (färgade organiska salter).
Å andra sidan kan bland färgämnena vi hitta några med basalt pH och andra med surt pH.
Grundfärgämnen
I grundläggande färgämnen har kromoforgruppen en positiv elektrisk laddning. Den stora majoriteten av prokaryota mikroorganismer har ett neutralt internt pH och deras cellyta är negativt laddad. Genom denna elektrostatiska interaktion binder kromoforen till cellen och färgar den.
Exempel på basiska färgämnen är metylenblått, violett kristall, malakitgrön, grundläggande fuscin, safranin, bland andra.
Sura färgämnen
I sura färgämnen har kromoforegruppen en negativ elektrisk laddning. Dessa används för färgning av proteiner med positivt laddade aminogrupper. Exempel på syrafärger är sur fuscin, ros Bengal, Kongo röd och eosin.
Differentiell färgning
Tekniken för differentiell färgning består i att applicera två färgämnen av olika färg eller intensitet för att skilja olika mikroorganismer under mikroskopet. Gramfärgning och syra-alkoholbeständighet färgning är de mest använda skillnad fläckar i bakteriologi.
Gramfärg används som ett preliminärt test för att känna till formen, storleken, cellgrupperingen, förutom typen av cellvägg. Genom Gram-fläcktestet klassificeras bakterier med cellvägg som Gram-positiva bakterier och gramnegativa bakterier.
Negativ färgning
I denna teknik används kemiska färgämnen som inte tränger in i den cellulära inredningen, men de gör det mediet där mikroorganismerna uppträder som en svart bakgrund.
I tekniken för negativ färgning framställs smeten med en droppe suspension av kinesisk bläck eller nigrosin, vilken efter att ha tillåtit torkning vid rumstemperatur bildar en film ogenomskinlig mot ljusets passage. På så sätt observeras mikroorganismerna som ljusa former på en mörk bakgrund.
beredning
A. Smörj
1.- Tvätta glidglasen mycket bra, torka med absorberande papper och märka dem. Märkningen måste ange innehållet i beredningen, datum och namn för den person som behandlade den.
2.- Ljusa tändaren och sterilisera ympslingan i flammen tills den är röd, varm.
3.- Låt handtaget svalna.
4.- Ta röret i bakteriekulturen, ta av locket och snabbt passera rörets mun nära lampans flamma (flamma).
5.- Introducera ympslingan inuti röret som innehåller bakteriekulturen och ta provet.
6.- Om kulturen är i flytande medium, placera provet taget med handtaget i mitten av glidbanan och sprid det försiktigt i en cirkel med ca 2 cm diameter.
7.- Re-sterilisera inokulationsslingan.
8.- Tillåt torkning av smet i luften.
9.- Upprepa steg 3 till 8 tre gånger.
10.- Om kulturen är i fast medium ska en droppe destillerat vatten placeras tidigare på gliden. Detta görs för att blanda ett litet urval av den kultur som tagits med inokulationshandtaget enligt indikationerna i steg 2 till 5 (tillstånd för asepsis).
11.- Utöka det utspädda provet med vattendroppen på glidbanan och upprepa tre gånger.
B. Fixering
1.- Lägg till de torra smutsarna som produceras från kulturer i flytande medium, två droppar metanol eller absolut etanol.
2.- Låt torka i luften bort från tändaren.
3.- Om smetet kommer från en kultur i fast medium, är det torra smetret fixerat med värme och passerar det 2-3 gånger snabbt genom det hetaste området i ljusändarens flamma.
4.- Tryck på undersidan av smet med dorsaldelen på vänster hand (för högerhänt, använd annars höger hand) och kontrollera att det är kallt.
C. Enkel färgning
1.- Lägg till 2 droppar av det valda färgämnet till smet och låt det fungera för den tid som krävs i de specifika protokollen för varje färgämne (vanligtvis mellan 1 och 5 minuter).
2.- Vissa färgämnen kräver användning av värme för aktivering, i vilket fall det är nödvändigt att vara mycket försiktig när värmen glider i ljusets flamma (manipulera den med pincett och undvik kokning). Överhettning av smeten kan förstöra de celler som du vill observera.
3.- Ta bort överskott av färgämne genom att tvätta med destillerat vatten från en pikett. Ta av tvättvattnet genom att försiktigt knacka på gliden på kanten, lutad på arbetsbordet.
4.- Tillåt lufttorkning.
5.- Beroende på typ av observation används en täckglas eller inte i detta skede. Skyddsglaset skyddar och bevarar smeten. Om en observation görs genom nedsänkning i olja vid detta stadium används ingen täckglas, men smetet kan inte bevaras.
D. Slutlig bevarande av smeten
1.- Doppa smältet successivt i var och en av de lösningar som anges nedan, i minst 5 minuter. Syftet med dessa "bad" är att låta smeten fullständigt uttorkas. Varje reagens måste dräneras, innan smöret införs i nästa bad.
Ordern för dehydreringsbadet är som följer:
- Etanol 70%
- 95% etanol
- Ren aceton
- Blanda aceton-xylol 1: 1
- xylen
Låt sedan lufttorkning.
2. Montera täckglaset, helst 22 × 22 mm, med kanadensisk balsam eller andra sätt att montera.
referenser
- Briggs, G. (1965). Orsakssamband i mikrobiologiska laboratorieolyckor och infektioner. US Army Biological Laboratories. Fort Detrick.
- Cappucino, J.G. och Welch, C.T. (2017). Mikrobiologi: En laboratoriehandbok. Pearson.
- Holt, J.G. Editor. (1977). Den kortare Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 8th Baltimore: Williams och Wilkins Co.
- Johnson, T.R. och fallet; CL (2018). Laboratorieexperiment inom mikrobiologi. Pearson.
- Tille, P. (2017). Diagnostisk mikrobiologi. 14th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.